Biologie · Licence 3 · 2 min de lecture
RNA-seq : normaliser et comparer une expression
Passer d'une table de comptages de lectures à une liste de gènes différentiellement exprimés, en sachant ce que chaque étape suppose. Pourquoi un comptage brut n'est pas comparable d'un échantillon à l'autre : profondeur de séquençage, composition de la librairie, longueur du transcrit. Ce que mesure un log2 fold change et pourquoi on travaille en logarithme de base 2 : la symétrie entre une multiplication et une division par le même facteur. Pourquoi un test par gène sur des dizaines de milliers de gènes produit des milliers de faux positifs au seuil de 5 %, et ce que corrige la procédure de Benjamini-Hochberg : elle contrôle la proportion attendue de faux positifs PARMI les gènes déclarés (le taux de fausses découvertes), et non la probabilité d'en commettre un seul. Lire un volcano plot : l'amplitude en abscisse, la significativité en ordonnée, et la raison pour laquelle les deux sont nécessaires. Distinguer significativité statistique et pertinence biologique, et savoir qu'une réplication BIOLOGIQUE ne se remplace pas par une réplication technique.
Chapitre du programme : Génomique fonctionnelle et analyse de données à haut débit
Bloc 1 sur 7 · Comprendre
Comprendre
Le RNA-seq produit des comptages de fragments attribués à des gènes ou transcrits après traitement des lectures. Ces comptages dépendent de l'expression mais aussi de la profondeur et de la composition des bibliothèques. Comparer directement deux nombres bruts peut confondre un effet technique de séquençage et un effet biologique.
Bloc 2 sur 7 · Approfondir
Approfondir
Une normalisation par facteurs de taille corrige certaines différences d'échelle entre échantillons. Les méthodes comme DESeq2 estiment ces facteurs à partir de nombreux gènes sous leurs hypothèses. Le log2 fold change décrit un rapport d'expression normalisée ; une inférence différentielle exige aussi répétitions biologiques, estimation de dispersion et prise en compte des tests multiples. Un rapport seul n'est pas une valeur-p.
Bloc 3 sur 7 · Exemple
Exemple travaillé
Un gène présente100 comptages dans A et200 dans B ; des facteurs de taille fournis valent1 et2. Les comptages normalisés valent100 et100, donc le rapport B/A vaut1 et le log2 fold change0. Sans normalisation, le rapport brut serait2 et son logarithme1. Cette correction montre une différence d'échelle des bibliothèques, sans établir une absence certaine de variation biologique : l'incertitude nécessite les répétitions et le modèle statistique.
Bloc 4 sur 7 · Visualiser
Visualiser le raisonnement
Le tableau sépare brut, facteur et normalisé avant le rapport. Les facteurs donnés sont des données du cas ; ils ne sont pas estimés à partir de ce seul gène. La comparaison reste descriptive et n'annonce aucun gène significativement différentiel.
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Sources
- https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html
- Love, Huber, Anders, DESeq2, Genome Biology2014 : https://doi.org/10.1186/s13059-014-0550-8
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