Acides aminés : ionisation, zwitterion, point isoélectrique

Un acide aminé, tel qu'on l'écrit dans les livres — $\mathrm{H_2N{-}CHR{-}COOH}$ — n'existe pratiquement pas en solution aqueuse. Il porte deux groupes ionisables sur le carbone alpha : un groupe carboxyle et un groupe amine. Chacun est un couple acide-base avec son propre $\mathrm{p}K_a$, et la forme réelle de la molécule dépend du pH.

Les deux couples.

• Le groupe $\alpha$-carboxyle : $\mathrm{COOH} \rightleftharpoons \mathrm{COO^{-}} + \mathrm{H^{+}}$, de $\mathrm{p}K_a$ voisin de $2$ (glycine : $2{,}34$). C'est un acide nettement plus fort que l'acide éthanoïque ($4{,}76$), parce que l'ammonium voisin, chargé positivement, attire les électrons et facilite le départ du proton.
• Le groupe $\alpha$-aminé : $\mathrm{NH_3^{+}} \rightleftharpoons \mathrm{NH_2} + \mathrm{H^{+}}$, de $\mathrm{p}K_a$ voisin de $9$ à $10$ (glycine : $9{,}60$). Son acide est l'ammonium, sa base l'amine.

La règle, héritée de la terminale. Pour un couple de $\mathrm{p}K_a$ donné : si $\mathrm{pH} < \mathrm{p}K_a$, la forme acide (protonée) prédomine ; si $\mathrm{pH} > \mathrm{p}K_a$, la forme basique (déprotonée) ; à $\mathrm{pH} = \mathrm{p}K_a$, les deux sont à égalité. Rien de nouveau — sauf qu'il faut maintenant l'appliquer à deux couples à la fois, sur la même molécule.

Les trois formes de la glycine, en montant le pH :

1. $\mathrm{pH} < 2{,}34$ : les deux groupes sont protonés, $\mathrm{H_3N^{+}{-}CH_2{-}COOH}$, charge nette $+1$.
2. $2{,}34 < \mathrm{pH} < 9{,}60$ : le carboxyle a perdu son proton, l'ammonium l'a gardé : $\mathrm{H_3N^{+}{-}CH_2{-}COO^{-}}$, charge nette $0$. C'est le zwitterion — un ion dipolaire, qui porte deux charges de signes opposés. Il n'est pas « sans charge » : il est globalement neutre. C'est lui qui prédomine au pH physiologique, et c'est pour cela que les acides aminés sont des solides cristallins à haut point de fusion, solubles dans l'eau, comme des sels.
3. $\mathrm{pH} > 9{,}60$ : les deux groupes sont déprotonés, $\mathrm{H_2N{-}CH_2{-}COO^{-}}$, charge nette $-1$.

L'ordre des formes suit les $\mathrm{p}K_a$ croissants : le groupe au $\mathrm{p}K_a$ le plus bas cède son proton en premier. Toujours trier les $\mathrm{p}K_a$ par valeur avant d'écrire les formes ; jamais dans l'ordre où l'énoncé les nomme.

Point isoélectrique. Le $\mathrm{pHi}$ (ou $\mathrm{p}I$) est le pH pour lequel la charge nette moyenne de la molécule est nulle. Pour un acide aminé à deux groupes ionisables, c'est la demi-somme des deux $\mathrm{p}K_a$ :

$$\mathrm{pHi} = \frac{\mathrm{p}K_{a1} + \mathrm{p}K_{a2}}{2}.$$

Pour la glycine : $\mathrm{pHi} = \dfrac{2{,}34 + 9{,}60}{2} = 5{,}97$. À ce pH, le zwitterion domine très largement, et les petites quantités de forme $+1$ et de forme $-1$ se compensent exactement. En dessous du $\mathrm{pHi}$, la molécule est globalement positive (le pH plus acide protone davantage) ; au-dessus, globalement négative. C'est la lecture qu'exploite l'électrophorèse : à un pH inférieur à son $\mathrm{pHi}$, un acide aminé migre vers la cathode (l'électrode négative) ; au-dessus, vers l'anode.

Un troisième couple. Sept acides aminés portent une chaîne latérale ionisable. Trois cas au programme :

• chaîne acide (carboxyle) : acide aspartique ($\mathrm{p}K_a$ : $1{,}88$ ; $3{,}65$ ; $9{,}60$) et acide glutamique ($2{,}19$ ; $4{,}25$ ; $9{,}67$) ;
• chaîne basique : lysine (ammonium de la chaîne, $10{,}53$ ; avec $2{,}18$ et $8{,}95$), arginine (guanidinium, $12{,}48$), histidine (imidazolium, $6{,}00$ ; avec $1{,}82$ et $9{,}17$). Avec trois $\mathrm{p}K_a$, il y a quatre formes successives, et la charge nette descend d'une unité à chaque $\mathrm{p}K_a$ franchi. La question est : laquelle des quatre a une charge nette nulle ?

Où est la forme neutre ? On part de la forme la plus protonée, dont la charge est le nombre de groupes cationiques (ammonium, guanidinium, imidazolium) — un carboxyle protoné est neutre, il ne compte pas.

• Acide aspartique : forme la plus protonée $\mathrm{H_3N^{+}{-}CHR(COOH){-}COOH}$, charge $+1$. Après le premier $\mathrm{p}K_a$ ($1{,}88$, $\alpha$-carboxyle) : charge $0$. Après le second ($3{,}65$, carboxyle latéral) : $-1$. Après le troisième ($9{,}60$) : $-2$. La forme neutre est encadrée par les deux $\mathrm{p}K_a$ les plus bas :

• Lysine : forme la plus protonée à deux ammoniums, charge $+2$. Après $2{,}18$ : $+1$. Après $8{,}95$ : $0$. Après $10{,}53$ : $-1$. La forme neutre est encadrée par les deux $\mathrm{p}K_a$ les plus hauts :

• Histidine : même schéma qu'une base ($+2 \to +1 \to 0 \to -1$ aux $\mathrm{p}K_a$ $1{,}82$, $6{,}00$, $9{,}17$) : $\mathrm{pHi} = \dfrac{6{,}00 + 9{,}17}{2} = 7{,}585$.

Le $\mathrm{pHi}$ est toujours la demi-somme des deux $\mathrm{p}K_a$ qui encadrent la forme de charge nette nulle — jamais la moyenne des trois. Chaîne acide : les deux plus petits. Chaîne basique : les deux plus grands. Pas de chaîne ionisable : les deux seuls.

La relation de Henderson-Hasselbalch. Pour un couple de $\mathrm{p}K_a$ donné, avec $c_{\mathrm{b}}$ la concentration de la forme basique (déprotonée) et $c_{\mathrm{a}}$ celle de la forme acide (protonée) :

Elle vient directement de la définition de $K_a$ ; elle n'est valable que pour un couple à la fois, et le rapport est base sur acide — l'inverser change le signe du logarithme et place le pH du mauvais côté du $\mathrm{p}K_a$. Deux lectures :

• du rapport vers le pH : un mélange où la forme basique est deux fois plus concentrée que la forme acide a un pH de $\mathrm{p}K_a + \log 2 \approx \mathrm{p}K_a + 0{,}30$ ;
• du pH vers le rapport : $\dfrac{c_{\mathrm{b}}}{c_{\mathrm{a}}} = 10^{\,\mathrm{pH} - \mathrm{p}K_a}$. À une unité de pH au-dessus du $\mathrm{p}K_a$, la forme basique l'emporte d'un facteur $10$ ; à deux unités, d'un facteur $100$.

Le pouvoir tampon. Un couple résiste aux variations de pH quand ses deux formes sont présentes en quantités comparables — c'est-à-dire au voisinage de son $\mathrm{p}K_a$ (environ une unité de part et d'autre). C'est ce qui rend l'imidazole de l'histidine ($\mathrm{p}K_a$ $6{,}00$) utile près du pH physiologique, voisin de $7{,}4$, alors que le groupe $\alpha$-carboxyle ($\mathrm{p}K_a$ près de $2$) n'y tamponne rien : à $\mathrm{pH} = 7{,}4$, le rapport carboxylate sur carboxyle de la glycine vaut $10^{7{,}4 - 2{,}34} = 10^{5{,}06}$, plus de cent mille — il ne reste pratiquement pas de forme acide pour absorber une base. Pour l'imidazole de l'histidine, $10^{7{,}4 - 6{,}00} = 10^{1{,}4} \approx 25$ : la forme acide est encore là, à quatre pour cent, et le couple travaille.

Une remarque de méthode. Le $\mathrm{p}K_a$ d'un même type de groupe varie d'un acide aminé à l'autre (carboxyle alpha : de $1{,}82$ pour l'histidine à $2{,}38$ pour le tryptophane), et d'un ouvrage à l'autre au centième près. C'est pourquoi un énoncé sérieux donne les $\mathrm{p}K_a$ ; on ne les récite pas, on les trie et on les utilise.

Énoncé. L'histidine porte trois groupes ionisables, dont on donne les $\mathrm{p}K_a$ : groupe $\alpha$-carboxyle $1{,}82$ ; groupe $\alpha$-aminé $9{,}17$ ; chaîne latérale (imidazole) $6{,}00$.

1. Écrire la suite des formes ioniques de l'histidine quand le pH augmente, avec la charge nette de chacune.
2. Calculer le point isoélectrique.
3. Quelle est la charge nette de l'histidine à $\mathrm{pH} = 4{,}0$ ? à $\mathrm{pH} = 8{,}0$ ? Vers quelle électrode migre-t-elle dans chaque cas ?
4. À $\mathrm{pH} = 7{,}40$, quel est le rapport imidazole (base) sur imidazolium (acide) ?
5. On prépare une solution où les formes imidazolium et imidazole sont dans le rapport $1$ pour $4$. Quel est son pH ?

---

1. Trier, puis dérouler. Les $\mathrm{p}K_a$ par valeur croissante : $1{,}82$ (carboxyle), $6{,}00$ (imidazolium), $9{,}17$ (ammonium) — pas dans l'ordre de l'énoncé. Forme la plus protonée : carboxyle $\mathrm{COOH}$ (neutre), imidazolium ($+1$), ammonium ($+1$) : charge nette $+2$.

• $\mathrm{pH} < 1{,}82$ : charge $+2$.
• $1{,}82 < \mathrm{pH} < 6{,}00$ : le carboxyle est devenu carboxylate ($-1$) ; charge nette $+1$.
• $6{,}00 < \mathrm{pH} < 9{,}17$ : l'imidazolium est devenu imidazole (neutre) ; charge nette $0$. C'est la forme de charge nette nulle : carboxylate $-1$, ammonium $+1$, imidazole $0$.
• $\mathrm{pH} > 9{,}17$ : l'ammonium est devenu amine ; charge nette $-1$.

2. Le point isoélectrique. La forme neutre est encadrée par $6{,}00$ et $9{,}17$ :

Moyenner les trois $\mathrm{p}K_a$ donnerait $5{,}66$ — un pH où l'histidine est nettement positive, ce qui est faux par construction.

3. La charge selon le pH. À $\mathrm{pH} = 4{,}0$, on est entre $1{,}82$ et $6{,}00$ : forme $+1$, la molécule migre vers la cathode. À $\mathrm{pH} = 8{,}0$, entre $6{,}00$ et $9{,}17$ : forme $0$ — mais $8{,}0 > 7{,}585$, la charge nette moyenne est légèrement négative (une petite fraction des molécules a déjà perdu le proton de l'ammonium, une fraction encore plus petite a gardé celui de l'imidazolium), et la migration se fait faiblement vers l'anode. Le $\mathrm{pHi}$ tranche : en dessous, positif ; au-dessus, négatif.

4. Du pH au rapport. Pour le couple imidazolium/imidazole :

À $\mathrm{pH} = 7{,}40$, il y a environ $25$ imidazoles pour un imidazolium : la forme basique domine, mais la forme acide reste présente à environ $4\ \%$ — assez pour tamponner.

5. Du rapport au pH. Forme acide $1$, forme basique $4$ : $\dfrac{c_{\mathrm{b}}}{c_{\mathrm{a}}} = 4$, et

Contrôle : le pH est au-dessus du $\mathrm{p}K_a$, ce qui est cohérent avec une forme basique majoritaire. Si l'on avait écrit le rapport à l'envers, on aurait trouvé $5{,}40$, du mauvais côté.

Lecture. Tout l'exercice tient en deux gestes : trier les $\mathrm{p}K_a$ et compter les charges forme par forme. Le $\mathrm{pHi}$ n'est pas une formule à retenir, c'est la position de la forme neutre dans la suite, lue sur les deux $\mathrm{p}K_a$ qui l'entourent.

Figure (fig.chemistry.acid-strength-predominance, figure programmatique de la leçon de terminale sur les acides forts et faibles, relue ici groupe par groupe) : trois bandes.

• Bande du haut. Deux béchers de même concentration apportée ($0{,}010$ mol/L). À gauche l'acide chlorhydrique, acide fort : dix ions oxonium, aucune molécule intacte, $\mathrm{pH} = 2{,}00$. À droite l'acide éthanoïque, acide faible : vingt-quatre molécules intactes pour une paire d'ions, taux d'avancement $4{,}1\ \%$, $\mathrm{pH} = 3{,}39$.
• Bande du milieu. Un axe de pH gradué de $0$ à $14$, avec la position du $\mathrm{p}K_a$ de l'acide éthanoïque, $4{,}76$, et de part et d'autre les domaines de prédominance : l'acide $\mathrm{CH_3COOH}$ à gauche, la base $\mathrm{CH_3COO^{-}}$ à droite, égalité au $\mathrm{p}K_a$.
• Bande du bas. Le lien entre force de l'acide, $K_a$ et $\mathrm{p}K_a$.

Ce qu'il faut y lire pour cette leçon. La bande du milieu est le dessin de ce chapitre, à ceci près qu'il faut le tracer deux fois sur le même axe pour un acide aminé simple, et trois fois pour une chaîne latérale ionisable. Imagine l'axe de la figure avec, pour la glycine, une frontière à $2{,}34$ et une autre à $9{,}60$ :

• à gauche de $2{,}34$, les deux groupes protonés, forme $+1$ ;
• entre les deux frontières, carboxylate et ammonium — le zwitterion, forme $0$, qui occupe tout le milieu de l'axe, pH physiologique compris ;
• à droite de $9{,}60$, forme $-1$ ;
• et, au milieu exact des deux frontières, en $5{,}97$, le point isoélectrique. Pour l'histidine, trois frontières ($1{,}82$ ; $6{,}00$ ; $9{,}17$) découpent l'axe en quatre domaines ($+2$, $+1$, $0$, $-1$), et le $\mathrm{pHi}$, $7{,}585$, est au milieu du domaine de charge nulle — entre les deux dernières frontières, pas au milieu de l'axe.

Ce que la figure met en garde. Sa frontière est à $4{,}76$ : c'est le $\mathrm{p}K_a$ d'un acide carboxylique isolé. Le carboxyle d'un acide aminé, lui, a sa frontière près de $2$ — plus de deux unités plus à gauche — parce que l'ammonium voisin le rend plus acide. Reporter le $4{,}76$ de la figure sur un acide aminé est une erreur classique ; la figure, en montrant l'acide éthanoïque et non la glycine, la rend visible.

La méthode, en trois lignes. Trier les $\mathrm{p}K_a$ par valeur croissante. Écrire la charge de la forme la plus protonée (nombre de groupes cationiques), puis retrancher $1$ à chaque $\mathrm{p}K_a$ franchi. Repérer la forme de charge $0$ : le $\mathrm{pHi}$ est la demi-somme des deux $\mathrm{p}K_a$ qui l'entourent.

Repères de rapport. $\log 2 \approx 0{,}30$ ; $\log 4 \approx 0{,}60$ ; $\log 10 = 1$. Une unité de pH au-dessus du $\mathrm{p}K_a$ : dix fois plus de forme basique ; une unité en dessous : dix fois plus de forme acide. Le pouvoir tampon est maximal à $\mathrm{pH} = \mathrm{p}K_a$ et devient négligeable au-delà d'environ une unité.

Ce qui n'est pas dans cette leçon. Le pH d'une solution d'acide aminé pur (résolution de l'électroneutralité), les courbes de titrage complètes et leur lecture quantitative, les peptides et la contribution des extrémités, l'électrophorèse bidimensionnelle, et tout lien entre une valeur de pH et un état physiologique ou pathologique.

1. Moyenner tous les $\mathrm{p}K_a$. Pour trois groupes ionisables, le $\mathrm{pHi}$ n'est jamais la moyenne des trois. L'histidine donnerait $5{,}66$ au lieu de $7{,}585$ ; l'acide aspartique $5{,}04$ au lieu de $2{,}765$. Seuls comptent les deux $\mathrm{p}K_a$ qui encadrent la forme neutre.
2. Prendre les $\mathrm{p}K_a$ dans l'ordre de l'énoncé. L'énoncé nomme les groupes ; la chimie les ordonne par valeur. Pour l'histidine, la chaîne latérale ($6{,}00$) se déprotone avant l'ammonium ($9{,}17$). Trier d'abord, toujours.
3. Croire que la forme neutre est sans charge. Le zwitterion porte un carboxylate ($-1$) et un ammonium ($+1$). Il est globalement neutre, pas dépourvu de charges — c'est ce qui explique la solubilité et le point de fusion élevé des acides aminés.
4. Inverser le sens de la charge autour du $\mathrm{pHi}$. Un pH plus acide que le $\mathrm{pHi}$ signifie plus de protons fixés, donc une charge nette positive, et une migration vers la cathode. Au-dessus, négative, vers l'anode.
5. Inverser le rapport de Henderson-Hasselbalch. C'est $\log\dfrac{c_{\mathrm{b}}}{c_{\mathrm{a}}}$, base au numérateur. À l'envers, le signe du logarithme change et le pH tombe du mauvais côté du $\mathrm{p}K_a$. Contrôle : forme basique majoritaire $\iff$ $\mathrm{pH} > \mathrm{p}K_a$.
6. Confondre le carboxyle d'un acide aminé et un acide carboxylique isolé. Le premier a un $\mathrm{p}K_a$ voisin de $2$, le second voisin de $4{,}8$. L'écart vient de l'ammonium voisin. Reporter $4{,}76$ sur la glycine décale toutes les frontières.
7. Inventer un $\mathrm{p}K_a$ à une chaîne latérale non ionisable. L'alanine, la valine, la sérine n'ont que deux groupes ionisables aux conditions usuelles. Un troisième équilibre n'existe pas ; l'énoncé, quand il ne donne que deux $\mathrm{p}K_a$, ne cache rien.
8. Appliquer Henderson-Hasselbalch à deux couples à la fois. La relation vaut pour un couple, avec ses deux formes. Le pH d'une solution d'acide aminé pur ne s'en déduit pas ; il demande l'électroneutralité, hors programme ici.
9. Lire « ionisable » comme « chargé ». Un groupe ionisable est parfois chargé, selon le pH. Le carboxyle est neutre en dessous de son $\mathrm{p}K_a$ ; l'amine est neutre au-dessus du sien. Compter les charges, c'est compter forme par forme, pas groupe par groupe.

Le modèle d'entraînement. L'exercice associé à cette leçon tire un acide aminé réel parmi dix-sept, écrit ses $\mathrm{p}K_a$ dans l'énoncé — dans l'ordre des groupes, pas dans l'ordre des valeurs — et demande, selon la variante, le point isoélectrique, un $\mathrm{p}K_a$ manquant quand le $\mathrm{pHi}$ et l'autre $\mathrm{p}K_a$ encadrant sont donnés, le pH d'un mélange des deux formes d'un même groupe dans un rapport donné, ou le rapport des deux formes à un pH donné. Les $\mathrm{p}K_a$ sont des multiples du centième et les réponses tombent juste. Un modèle voisin, à choix multiples, donne un pH et demande la forme ionique majoritaire d'un acide aminé à chaîne latérale ionisable, parmi ses quatre formes successives.

Énoncé type. La lysine porte trois groupes ionisables. On donne : groupe $\alpha$-carboxyle, $\mathrm{p}K_a = 2{,}18$ ; groupe $\alpha$-aminé, $\mathrm{p}K_a = 8{,}95$ ; chaîne latérale (groupe amine), $\mathrm{p}K_a = 10{,}53$. Calculer le point isoélectrique de la lysine.

Corrigé complet.

1. Trier les $\mathrm{p}K_a$. Par valeur croissante : $2{,}18$ (carboxyle) $< 8{,}95$ (ammonium alpha) $< 10{,}53$ (ammonium de la chaîne). Ici l'ordre des valeurs coïncide avec celui de l'énoncé ; ce n'est pas toujours le cas.

2. Charger la forme la plus protonée. À pH très bas : carboxyle $\mathrm{COOH}$ (neutre), deux ammoniums ($+1$ chacun). Charge nette $+2$.

3. Dérouler les formes. Après $2{,}18$ : le carboxyle devient carboxylate, charge $+1$. Après $8{,}95$ : l'ammonium alpha devient amine, charge $0$. Après $10{,}53$ : l'ammonium de la chaîne devient amine, charge $-1$. La suite est $+2 \to +1 \to 0 \to -1$.

4. Repérer la forme neutre et ses encadrants. La charge $0$ apparaît entre $8{,}95$ et $10{,}53$ — les deux $\mathrm{p}K_a$ les plus hauts, comme pour toute chaîne latérale basique.

5. Calculer.

6. Contrôler. Le $\mathrm{pHi}$ est bien entre ses deux encadrants ($8{,}95 < 9{,}74 < 10{,}53$), il est nettement basique — cohérent pour un acide aminé basique — et il n'est pas la moyenne des trois ($7{,}22$), qui tomberait dans le domaine de charge $+1$.

Réponse : $\mathrm{pHi} = 9{,}74$.

Auto-contrôle. Ai-je trié les $\mathrm{p}K_a$ par valeur avant d'écrire les formes ? Ai-je compté la charge de départ comme le nombre de groupes cationiques (le carboxyle protoné vaut $0$) ? Ai-je repéré la forme de charge nulle, et pris les deux $\mathrm{p}K_a$ qui l'entourent — les deux plus hauts pour une base, les deux plus bas pour un acide ? Mon $\mathrm{pHi}$ est-il compris entre ces deux valeurs ?