La PCR : copier des millions de fois une région choisie

La PCR utilise un ADN matrice, des amorces, une polymérase, des nucléotides et des conditions de réaction adaptées pour amplifier une région. Une PCR simple utilise une paire d’amorces ; une PCR multiplex peut viser plusieurs régions. Un appariement non spécifique, une contamination ou des dimères d’amorces peuvent produire d’autres signaux.

Le cycle usuel sépare les brins par chauffage, permet l’hybridation des amorces, puis leur extension. Des repères comme 95 °C pour la séparation et 72 °C pour l’extension concernent des protocoles courants avec Taq ; ils ne sont pas des températures universelles de toutes les polymérases.

Une amorce doit fournir une extrémité 3′ utilisable. La polymérase ajoute des nucléotides dans le sens 5′→3′. Les deux sites et leur orientation encadrent la région qui peut croître exponentiellement. La complémentarité ne garantit pas à elle seule un site unique dans tout génome ; répétitions et mésappariements comptent.

La thermodynamique d’hybridation dépend des séquences, de l’empilement des bases, des sels et des concentrations. Compter seulement deux ou trois liaisons hydrogène ne suffit pas à calculer une température de fusion. Une polymérase thermostable supporte les cycles du protocole sans être éternellement insensible à la chaleur.

Le modèle de doublement idéal donne $N_n=N_0 2^n$ pour n entier positif ou nul. Il suppose une copie complète par brin à chaque cycle, sans perte ni limite. Avec des efficacités par cycle E_j, le modèle moyen devient $N_n=N_0\prod_{j=1}^n(1+E_j)$, avec 0≤E_j≤1 dans le cadre retenu. Ce nombre peut être une espérance, pas un compte entier garanti dans chaque tube.

La formule $N_0(2^n-2n)$ de molécules double brin exactement bornées s’applique pour n≥1 au modèle idéal partant de matrices double brin plus longues que la cible des deux côtés. Les premières apparaissent au cycle 3. Une matrice initiale déjà exactement bornée ne suit pas cette même correction. Les premiers produits longs ne sont pas tous des copies exactes ; l’extension complète et les conventions d’appariement sont des hypothèses de comptage.

Un plateau peut résulter de plusieurs facteurs : réactifs, activité enzymatique, réassociation des produits, produits non spécifiques ou inhibiteurs. Il n’est pas forcément au même niveau pour tous les tubes. L’épuisement d’un réactif est une borne de possibilité, pas la preuve de la forme complète d’une courbe.

Une bande finale de taille attendue n’identifie pas seule toute la séquence ni sa provenance. Un résultat négatif peut provenir de conditions techniques. Des témoins et, selon l’objectif, d’autres vérifications sont nécessaires. La qPCR utilise des mesures pendant l’amplification avec calibration et efficacité contrôlées ; une PCR finale peut parfois être semi-quantitative sous conditions, sans devenir une mesure universelle de la quantité initiale.

Deux expériences alternatives, données construites. Le départ contient 3 matrices double brin plus longues que la cible.

A : cinq cycles de doublement idéal puis trois cycles avec efficacité moyenne E=0,5. Après cinq cycles : $3\times2^5=96$. Après trois autres : $96(1{,}5)^3=324$ copies attendues. Le doublement idéal huit fois aurait donné 768. Le passage de l’espérance au-dessus de 300 arrive au huitième cycle : au septième, $96(1{,}5)^2=216$. Cela n’assure pas que chaque réalisation franchisse ce seuil à ce cycle.

B : on revient à un modèle entièrement idéal, mais chaque type d’amorce est limité à 700 molécules disponibles. Après n cycles, la consommation de chaque type vaut $3(2^n-1)$ dans le modèle symétrique : chaque cycle ajoute des brins de chaque orientation. Au cycle 7, 381 amorces de chaque type ont été consommées ; au cycle 8, il en faudrait 765. L’hypothèse de doublement complet ne peut donc plus rester valide jusqu’à la fin du cycle 8. On ne déduit pas pour autant un nombre final exact ni un plateau de 700 copies.

Sous réactifs en excès, après quatre cycles idéaux on compterait $3(16-8)=24$ molécules double brin exactement bornées sur 48. Cette dernière formule ne s’applique pas telle quelle à A, où l’efficacité varie.

La figure partagée montre un fragment canonique d’ADN apparié et une hélice B approximative. Les formes symboliques et les pointillés illustrent l’appariement ; ils ne constituent pas une preuve qu’aucun mésappariement ne peut survenir.

Pour concevoir une amorce, il faut ajouter les extrémités 5′ et 3′ et préciser le sens dans lequel chaque séquence est écrite. Le complément face à face et le complément inversé écrit en 5′→3′ ne sont pas la même chaîne de caractères. La figure ne place ni les amorces, ni une polymérase, ni les cycles de température.

L’hybridation et la dénaturation modifient les interactions entre brins ; la synthèse ajoute des liaisons covalentes le long d’un nouveau brin. La figure ne permet pas de garantir l’absence de dégradation dans tout protocole ni une quantité finale de PCR. Elle est conservée sans nouvelle géométrie.